土壤堿性蛋白酶(S-ALPT)試劑盒

土壤堿性蛋白酶(S-ALPT)試劑盒

土壤堿性蛋白酶(S-ALPT)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 土壤堿性蛋白酶（Solid-Alcalase Protease, S-ALPT）試劑盒說明書 （貨號：WS4130F 分光法 24 樣） 一、產品簡介： 蛋白酶是廣泛存在于土壤中的一大酶類，它能水解各種蛋白質以及肽類等化合物為氨基酸，因此土壤 蛋白酶的活性與土壤中氮素的轉化狀況有極其重要的關系。 土壤堿性蛋白酶（S-ALPT）在堿性條件下將酪蛋白水解產生酪*酸；酪*酸與福林酚在堿性條件下反 應生成藍色化合物；該藍色物質在 680nm 有特征吸收峰，進而得 S-ALPT 酶活，由于底物酪蛋白自身含有 多種氨基酸，所以在檢測過程中必須設置帶有底物酪蛋白的對照，以扣除有干擾的背景值，排除假陽性。 二、測試盒組成和配制： 試劑名稱 規格試劑名稱 保存要求 備注 試劑一 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，每 瓶加入 3mL 試劑三 90℃加熱攪拌 至分散（約 10-20min），再加 12mL 試劑一攪拌至溶解，最后再加試劑 一定容至 30mL,繼續攪拌至全部溶 解（約 30min）；配置完的試劑 4℃ 保存，三天內用完。 試劑三 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻 試劑四 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻 試劑五 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻 試劑六 液體 5mL×1 棕色瓶 4℃保存 現用現配，臨用前加 10mL 蒸餾水， 4℃保存，一星期內用完 標準品 粉體 mg×1 支 EP 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 【注】：試劑二若在磁力攪拌器（帶溫控）上溶解，可用錫箔紙或保鮮膜蓋住燒杯，以免溶解過程中水 分蒸發過快。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、磁力攪拌器、可調式移液槍 四、土壤堿性蛋白酶（S-ALPT）的測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 取新鮮土樣或者 37 度烘箱風干（需先粗研磨），過 40 目篩網備用。 2、上機檢測： ① 分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 680nm，蒸餾水調零。 ② 配制好的試劑二需預先 50℃水浴 10min。 ③ 在 EP 管中依次加入下列試劑培養： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 土樣（g） 0.15g 鮮土 或 0.1g 干土 0.15g 鮮土 或 0.1g 干土 試劑一 500 500 試劑二 500 50℃振蕩培養 2h，同時，余下的試劑二須單獨 50℃振蕩培養 2h本試劑盒僅供科研使用 2 上歩單獨 50℃培養過的試劑二 500 試劑四 500 500 混勻，立即 1700rpm（須準確），4℃離心 10min，上清液待用 ④ 顯色反應：在 EP 管中依次加入： 上清液 250 250 試劑五 375 375 試劑六 250 250 室溫靜置 20min（若仍渾濁，可以延長靜置時間至 30min 或 1700rpm 離心 10min），取全部上清液于 1mL 玻璃比色皿中， 于 680nm 讀取吸光值 A，△A=A 測定管-A 對照管 【注】：若△A 的值在零附近徘徊，可以加樣土樣取樣量（如兩倍的土壤質量）。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.1144x + 0.0034，x 是標準品質量（μg），y 是ΔA。 2、單位定義：每小時每克鮮土中產生 1μg 酪*酸為一個酶活力單位。 土壤堿性蛋白酶(S-ALPT) (μg/h/g 鮮土)=(ΔA-0.0034)÷0.1144÷(W1×V1÷V2)÷T =26.2×(ΔA-0.0034) ÷W1 3、單位定義：每小時每克干土中產生 1μg 酪*酸為一個酶活力單位。 同等質量的鮮土（參與實際反應的鮮土質量）在 105℃烘干，即得相應的干土質量。 土壤堿性蛋白酶(S-ALPT) (μg/h/g 干土)= (ΔA-0.0034)÷0.1144÷(W2×V1÷V2)÷T =26.2×(ΔA-0.0034) ÷W2 V1---顯色反應步驟中加入的上清液體積，250μL =0.25mL； V2---培養步驟中總的反應體積，1500μL =1.5mL； T---反應時間，2h； W1---樣本質量，以實際稱取鮮土質量為準； W2---相對應的干土質量。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（100μg/mL）：標準品溶解于 100mL 的 0.1mol/L 的鹽酸溶液中（母 液需在兩天內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 4, 8, 12, 16, 20. μg/mL。也可根據實際樣本 來調整標準品濃度。 3 依據測定管的顯色反應階段加樣表依次加樣，根據結果即可制作標準曲線。