甲酸脫氫酶(FDH)活性測定試劑盒

甲酸脫氫酶(FDH)活性測定試劑盒

甲酸脫氫酶(FDH)活性測定試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 甲酸脫氫酶(Formate dehydrogenase，FDH)試劑盒說明書 (貨號：WS5440F 紫外法 48 樣) 一、產品簡介： 甲酸脫氫酶(FDH，EC 1. 2. 1. 2)屬于 D-2-羥基酸脫氫酶類，廣泛應用于輔酶 NADH 的再 生中。 本試劑盒利用甲酸脫氫酶(FDH)催化甲酸和 NAD+不可逆反應生成二氧化碳和 NADH，通 過檢測 NADH 在 340nm 的生成速率，進而計算出甲脫氫酶(FDH)活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×2 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，每支再加 0.6mL 蒸餾水溶解。 試劑二 粉劑 mg×2 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，每支再加 0.6mL 蒸餾水溶解。 試劑三 液體 35mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、臺式離心機、可調式移液器、研缽、 冰和蒸餾水。 四、甲酸脫氫酶(FDH)活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 細菌/培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數 量（104個）：建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴， 功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；12000rpm, 4℃離心 10min，取 上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照數量（104 個）：提取液體積為 500~1000：1 的比例進行提取 ② 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 紫外分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。 ② 試劑解凍至室溫（25℃）或于 25℃水浴中孵育 10min； ③ 在 1mL 石英比色皿（光徑 1cm）中按照下表依次加入試劑： 試劑名稱（µL） 測定管 樣本 60 試劑一 20 試劑二 20 試劑三 620 混勻，立即于 340nm 處讀取 A1，35℃條件 下孵育 10min 后讀取 A2，ΔA＝A2-A1。 【注】：1. 若ΔA 過小如小于 0.01，可增加樣本體積 V1（如增至 120μL，則試劑三相應減 少），或延長反應時間 T（如：30min）或增加樣本質量 W（如增加為 0.2g），重 新調整后 V1 和 T 和 W 需代入公式重新計算。 2. 若ΔA 值大于 0.5 且 A2 值大于 1.8，需減少樣本體積 V1（如減至 30μL，則試劑 三相應增加），或縮短反應時間 T（如：2min 或更短），重新調整后的樣本體積本試劑盒僅供科研使用 2 V1 和反應時間 T 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADH 的酶量為 1 個酶活單位。 FDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×109×V2]÷(V1×Cpr)÷T=193×ΔA÷Cpr 2、按細菌/細胞密度計算： 酶活定義：每一萬個細菌/細胞每分鐘生成 1 nmol NADH 的酶量為 1 個酶活單位。 FDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=193×ΔA÷500 3、按液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體樣本每分鐘生成 1nmol NADH 的酶量為 1 個酶活單位。 FDH 酶活(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=193×ΔA V1---加入樣本體積，0.06mL； V---加入提取液體積，1mL； V2---反應體系總體積，7.2×10-4 L； d---光徑，1cm； 500---細菌或細胞總數，萬； W---樣本質量，g； ε---NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm； T---反應時間，10min； Cpr---蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。