焦磷酸：果糖6磷酸1磷酸轉(zhuǎn)移酶(PFP)試劑盒

焦磷酸：果糖6磷酸1磷酸轉(zhuǎn)移酶(PFP)試劑盒

焦磷酸：果糖6磷酸1磷酸轉(zhuǎn)移酶(PFP)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（Pyrophosphate: fructose-6 – phosphate-1-phosphoric acid transferase，PFP）試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS7060F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一種胞質(zhì)酶，廣泛存在于 植物組織中，催化果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，在光合作用碳代謝 中起重要作用。 PFP 催化 6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為 1,6-二磷酸果糖，接著在醛縮酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶的作 用下轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岫u丙酮，再由 3-磷酸甘油脫氫酶催化，并使 NADH 在 340nm 處的吸 光度下降，由此反映 PFP 酶活性高低。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×2 支 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 每支再加 3.1mL 的蒸餾水，用 不完的試劑分裝后-20℃保存， 禁止反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑二 液體μL×1 瓶 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 6.1mL 的蒸餾水溶解 試劑三 液體 3mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、移液 槍、研缽、冰和蒸餾水。 四、焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP）酶活測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí) 驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 20min， 取上清置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 2、上機(jī)檢測： ① 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 340nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 依次在 1mL 石英比色皿中加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 60 提取液 340 試劑一 120 試劑二 120 試劑三 60 混勻，室溫（25℃）條件下，10s 時(shí)于 340nm 處讀取吸光值 A1，20min 后讀取 吸光值 A2，△A=A1-A2。本試劑盒僅供科研使用 2 【注】1.若△A 的值在零附近，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間到 30min 或更長讀取 A2，改變后的反 應(yīng)時(shí)間需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。或適當(dāng)加大樣本量，則改變后的加樣體積 V1 需代 入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2. 若起始值 A 太大如超過 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對(duì) 會(huì)偏高），可以適當(dāng)減少樣本加樣量，則改變后的加樣體積需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 或向待測樣本中加少許活性炭混勻靜置 5min 后 12000rpm, 4℃離心 10min，上清液 用于檢測； 3. 若ΔA 的值大于 0.5，則需減少反應(yīng)時(shí)間（如減少至 5min），則改變后的反應(yīng)時(shí)間 T 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 4. 若下降趨勢(shì)不穩(wěn)定，可以每隔 10S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來 參與計(jì)算，相對(duì)應(yīng)的 A 值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按照樣本蛋白濃度計(jì)算 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PFP（nmol/min/mg prot）＝[ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(Cpr×V1÷V) ÷T=93.78×ΔA÷Cpr 2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算 酶活定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PFP（nmol/min/g 鮮重）＝[ ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W ×V1÷V) ÷T=93.78×ΔA÷W ε---NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； d---比色皿光徑，1cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.06mL； V2---反應(yīng)體系總體積，0.7mL=7×10-4L； T---反應(yīng)時(shí)間，20 min； W---樣本質(zhì)量，g Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。