α-木糖苷酶試劑盒

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α-木糖苷酶試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 α-木糖苷酶（α- xylosidase）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS3170F 分光法 24 樣） 一、產品簡介 ： α-木糖苷酶(EC 3.2.1.177)是一類木聚糖降解水解酶，存在于植物、細菌和真菌等生物 體，促使非還原末端α-D-木糖殘基的水解，釋放出α-D-木糖。 α-木糖苷酶催化對硝基*酚-α-D-木糖苷產生對硝基*酚（PNP），該產物在 405nm 處 有特征吸收峰，通過測定 405nm 光吸收增加速率，即可計算α-木糖苷酶活性。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 2mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液 27mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、可調式移液器、低溫離心機、天平、 研缽、冰和蒸餾水。 四、α-木糖苷酶活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本的制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰 浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】若增加樣本量，可按照組織質量(g)：提取液體積(mL)為 1：5~10 比例提取。 ② 細菌或細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細 胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】若增加樣本量，可按照細菌或細胞數量(104 個)：提取液體積(mL)為 500~1000：1 的比例提取。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min，調節波長至 405nm，蒸餾水調零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 30 30 試劑一 75 蒸餾水 75 試劑二 135 135 迅速混勻，40℃保溫 20min 試劑三 540 540 混勻，取全部澄清液體轉移至 1mL 玻璃比色皿中，于 405nm 處測定吸光值 A，ΔA=A 測定-A 對照（每個測定本試劑盒僅供科研使用 2 管需設一個對照管）。 【注】：若ΔA 低于 0.01，可增加樣本取樣量 V1（如增至 60μL，則試劑三相應減少）， 或延長保溫時間（如：40min 或更長），或增加樣本質量 W，則改變后的 V1 和 T 和 W 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y=0.0194x+0.0028；x 為標準品摩爾質量（nmol），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計算： 定義：40℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產生 1 nmol 對硝基*酚（PNP）為一個酶活單位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0028)÷0.0194÷(V1×Cpr)÷T =85.9×(ΔA-0.0028)÷ Cpr 3、按樣本質量計算： 定義：40℃下，每克組織每分鐘催化產生 1 nmol 對硝基*酚（PNP）為一個酶活單位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷(V1÷V×W)÷T =85.9×(ΔA-0.0028)÷W 4、按細胞數量計算： 定義：40℃下，每 104個細胞每分鐘催化產生 1 nmol 對硝基*酚（PNP）為一酶活單位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷(V1÷V×細胞數量)÷T =85.9×(ΔA-0.0028)÷細胞數量 5、按液體體積計算： 定義：40℃下，每毫升液體每分鐘催化產生 1 nmol 對硝基*酚（PNP）為一個酶活單位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷V1÷T=85.9×(ΔA-0.0028) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應體系中樣本體積，30μL=0.03mL； W---樣本質量，g； 500---細胞或細菌總數，500 萬； T---反應時間，20min； PNP 對分子質量---139.11； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3 mg/mL。也可根據實 際樣本來調整標準品濃度。 3 在 EP 管加入：30μL 標準品+75μL 蒸餾水+135μL 試劑二+540μL 試劑三，混勻，取 全部澄清液體轉移至 1mL 玻璃比色皿中，于 405nm 下讀取吸光值。 4 根據結果制作標準曲線。