β-甘露糖苷酶活性檢測試劑盒

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本試劑盒僅供科研使用 1 β-甘露糖苷酶（β-Mannosidase,β-Man）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS1270F 分光法 24 樣） 一、產(chǎn)品簡介 ： β-甘露糖苷酶（EC 3.2.1.25, β-Man）屬于外切水解酶類，又稱 β-D-露糖苷甘露糖水解 酶、外切-β-D-甘露聚糖酶，它能夠催化結合甘露寡聚糖末端非還原性的 β-1，4-D-糖苷 鍵，并切下一個甘露糖分子，是甘露聚糖*全降解所必需的水解酶。 β-甘露糖苷酶（β-Man）催化對硝基*酚-β-D-吡喃甘露糖苷產(chǎn)生對硝基*酚（PNP）， 該產(chǎn)物在 405nm 處有特征吸收峰，通過測定 405nm 光吸收增加速率，即可計算β-甘露 糖苷酶活性。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、可調(diào)式移液器、低溫離心機、天平、 研缽、冰和蒸餾水。 四、β-甘露糖苷酶（β-Man）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本的制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰 浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量(g)：提取液體積(mL)為 1：5~10 比例提取。 ② 細菌或細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細 胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】若增加樣本量，可按照細菌或細胞數(shù)量(104個)：提取液體積(mL)為 500~1000：1 的比例提取。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 405nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 30 30 試劑一 40 試劑二 300 340 迅速混勻，37℃保溫 30min 試劑三 350 350本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，5min 后立即于 405nm 下讀取吸光值 A，ΔA=A 測定-A 對照（每個測定管需設一個對照管）。 【注】：1. 若ΔA 在零附近，可增加樣本加樣體積 V1（即加樣量增加至 60μL，則試劑二相應減 少），或延長保溫時間 T（如：由 30min 延長至 60min 或更長），重新調(diào)整的 V1 和 T 需代入計算公式重新計算。 2. 若 A 測定值大于 1.5，可對樣本上清液用蒸餾水稀釋，則稀釋倍數(shù) D 代入公式計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.0173x - 0.0065；x 為標準品摩爾質(zhì)量（nmol），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基*酚(PNP)為一個酶活單位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0065) ÷0.0173÷(V1×Cpr)÷T×D =64.23×(ΔA+0.0065)÷ Cpr×D 3、按樣本質(zhì)量計算： 酶活定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基*酚(PNP)為一個酶活單位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA+0.0065) ÷0.0173÷(V1÷V×W)÷T×D =64.23×(ΔA+0.0065)÷W×D 4、按細胞數(shù)量計算： 酶活定義：每 104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基*酚(PNP)為一酶活單位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(ΔA+0.0065) ÷0.0173÷(V1÷V×細胞數(shù)量)÷T×D =64.23×(ΔA+0.0065)÷細胞數(shù)量×D 5、按液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對硝基*酚(PNP)為一個酶活單位。 β-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0065) ÷0.0173÷V1÷T×D =64.23×(ΔA+0.0065)×D V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應體系中樣本體積，30μL=0.03mL； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細胞或細菌總數(shù)，500 萬； T---反應時間，30min； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（10μmol/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標準品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根據(jù)實際 樣本來調(diào)整標準品濃度。 3 在 EP 管中依次加入：30μL 標準品+340μL 試劑二+350μL 試劑三，混勻轉移全部液 體至 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，于 405nm 下讀取吸光值，根據(jù)結果制作標 準曲線。