脲酶(UE)試劑盒

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脲酶(UE)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 脲酶（Urease，UE）測定試劑盒說明書 (貨號：WS2140F 分光法 24 樣) 一、產品簡介： 脲酶（UE；EC 3.5.1.5）是一種含鎳的寡聚酶，特異性地催化尿素水解釋放出氨和二氧化碳。脲酶活性 與有機物質含量、全氮和速效氮含量呈正相關，反應了氮素狀況。 本試劑盒利用靛酚藍比色法測定脲酶水解尿素產生的 NH3-N，其在強堿性介質中與次氯酸鹽和*酚反 應，生成水溶性染料靛酚藍，其深淺與溶液中的 NH3-N 含量呈正比，該物質在 578nm 有光吸收，其 深淺與溶液中的 NH3-N 含量呈正比，進而得出脲酶活力大小。 二、測試盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60 mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 g×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底部，再加 入 3mL 蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑 4℃保存。 試劑三 液體 13mL×1 瓶 4℃保存 避光保存。 試劑四 液體 7mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 A：液體 7mL×2 瓶 B：液體μL×1 支 4℃保存 臨用前取 60μL 的 B 液進一瓶 A 液中，混勻后作為 試劑五使用。混勻后的試劑五一周內用完。 標準品 液體 1 mL×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、離心機、可調式移液器、研缽。 四、脲酶（UE）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、 樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，冰浴 勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌/細胞樣本：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或 細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、 上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 578nm，蒸餾水調零。 ② 在 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本上清液 20 20 試劑一 190 190 試劑二 90 蒸餾水 90 混勻，放入 40℃水浴鍋或恒溫培養箱中孵育 1h ③ 顯色反應：在 EP 管中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 ②步反應混合液 60 60 蒸餾水 180 180 試劑三 240 240 試劑四 120 120 試劑五 240 240 充分混勻，37℃放置 20min 后，全部液體轉移至 1mL 玻璃比 色皿（光徑 1cm）中，于 578nm 處讀取吸光值 A， ΔA=A 測定管-A 對照管（每個樣本做一個自身對照）。 【注】1. 試劑三和四和五需分開加，不能事先混合。 2. 若ΔA 值較小，可增加取樣質量 W（如 0.2g 或更多）或在②步中增加樣本加樣體積 V1（如增至 50μL，則試劑一相應減少），或在③步顯色反應階段增加上清液量 V2(如增至 100μL，則蒸餾水 體積相應減少)；則改變后的 W 和 V1 和 V2 需代入計算公式重新計算。 3. 若 A 測定值大于 1.8，可在③步階段減少上清液量 V2(如減至 30μL，則蒸餾水體積相應增加)； 或用蒸餾水稀釋③步檢測用到的上清液，則改變后的 V2 和稀釋倍數 D 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程為 y=1.0438x - 0.0015；x 為標準品質量（μg），y 為吸光值ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘產生 1μg 的 NH3-N 定義為一個酶活力單位。 脲酶(UE)(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷(V1×Cpr)÷T×D =4×(ΔA+0.0015)÷Cpr×D 3、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每分鐘產生 1μg 的 NH3-N 定義為一個酶活力單位。 脲酶(UE)(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷(W×V1÷V)÷T×D =4×(ΔA+0.0015)÷W×D 4、按細胞數量計算： 酶活定義：每 104個細胞每分鐘產生 1μg 的 NH3-N 定義為一個酶活力單位。 脲酶(UE) (μg/min/104 cell)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷(500×V1÷V)÷T×D =0.008×(ΔA+0.0015)×D 5、按液體體積計算: 酶活定義：每毫升液體每分鐘產生 1μg 的 NH3-N 定義為一個酶活力單位。 脲酶(UE)(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0015)÷1.0438]×(V3÷V2)÷V1÷T×D=4×(ΔA+0.0015)×D V---提取液體積，1mL； V1---②步反應體系中樣本加樣體積，0.02mL； V2---③步顯色階段上清液體積，0.06mL； V3---②步反應總體積，0.3mL； T---反應時間，60min；W---樣本質量，g； 500---細胞數量； D---稀釋倍數，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1. 把標準品母液（1mg/mL），用蒸餾水稀釋成以下濃度梯度的標準品：0,2,4,6,8,10. μg/mL。也可根據 實際樣本來調整標準品濃度。 2. 在③步顯色反應階段，按照測定管加樣表操作，依據結果即可制作標準曲線。