二氫黃酮醇還原酶(DFR)試劑盒

二氫黃酮醇還原酶(DFR)試劑盒

二氫黃酮醇還原酶(DFR)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 二氫黃酮醇還原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)試劑盒說明書 （WS8001F 分光法 24 樣） 一、產品簡介： 二氫黃酮醇還原酶（DFR，EC 1.1.1.219）是花色苷合成代謝中的一個關鍵酶，負責將 3 種二氫黃酮醇還原成無色花色素。在決定植物的花色、葉色、果色和其他經濟器官的色澤 及其營養品質方面起著重要作用。 二氫黃酮醇還原酶（DFR）作用于二氫槲皮素產生兒茶素，可與香*醛縮合形成紅色化 合物，在 500nm 處有特征吸收峰進而得出 DFR 的酶活性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 25mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體×1 支 4℃保存 臨用前離心或甩幾下使試劑落入底部， 再加 1.5mL 乙醇充分溶解，4℃保存。 試劑三 粉體×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，分 別加 1.5mL 蒸餾水溶解備用。用不完的 試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融， 三天內用完。 試劑四 粉體×1 瓶 4℃保存 臨用前離心或甩幾下使試劑落入底部， 再加 36mL 鹽酸充分溶解，4℃保存。 標準品 粉體×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、臺式離心機、可調式移液器、研缽、 乙酸乙酯、無水乙醇、冰。 四、二氫黃酮醇還原酶（DFR）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，溫度設定 25℃，調節波長至 500nm。 ② 試劑放在 40℃水浴 5min； ③ 按照下表在 EP 管中依次加入試劑： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 100 100 試劑一 325 375 試劑二 50 試劑三 25 25本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，40℃反應 30min 乙酸乙酯 500 500 37℃震蕩 10min，取上層溶液，N2 吹干 無水乙醇 250 250 充分震蕩混勻，待檢液按照下表操作 ④ 在 EP 管中直接加入以下試劑： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 待檢液 200 200 試劑四 600 600 混勻，25℃靜置 3min，立即于 500nm 處讀取吸光 值 A（10min 內讀值完成）?！?/span>A=A 測定管-A 對照 管（每個樣本做一個自身對照）。 【注】：若ΔA 在零附近徘徊，可延長反應時間 T（如：50min 或更長）， 或加大樣本量 V1（如增至 150μL，試劑一相應減少），重新 調整后的反應時間 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程為：y=0.0263x-0.0028，x 是標準品濃度（μg/mL），y 是△A。 2、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克蛋白每小時分解二氫槲皮素產生1μg兒茶素所需酶量為一酶活單位（U）。 DFR（μg/h/mg prot）＝[(ΔA+0.0028)÷0.0263×V 乙醇]÷(V1×Cpr) ÷T =190.1×(ΔA+0.0028)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克樣本每小時分解二氫槲皮素產生 1μg 兒茶素所需酶量為一酶活單位（U）。 DFR（μg/h/g 鮮重）＝[(ΔA+0.0028)÷0.0263×V 乙醇]÷(W×V1÷V) ÷T =190.1×(ΔA+0.0028)÷W V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.1mL； T---反應時間，30 min=0.5h； V 乙醇---0.25mL； W---樣本質量，g。 Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測定試劑盒； 附：標準曲線制作過程： 1 標準品母液（1mg/mL）：臨用前加 1mL 無水乙醇溶解（1mg/mL）。 2 用無水乙醇把標準品稀釋成以下濃度：0，8，16，24，32，40. μg/mL。也可根據實 際來調整標準品濃度。 3 按照第④步驟測定管的加樣表操作，依據結果即可制作標準曲線。