γ-谷an酸激酶(γ-GK)試劑盒

γ-谷an酸激酶(γ-GK)試劑盒

γ-谷an酸激酶(γ-GK)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 γ-谷*酸激酶（γ-GK）酶活測(cè)定試劑盒說(shuō)明書 （貨號(hào)：WS5011W 分光法 24 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： γ-谷an酸激酶(γ-GK，EC 2.7.2.11)是脯*酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。催化由谷*酸生成脯*酸途徑的步反應(yīng)。 本試劑盒利用γ-GK 催化谷*酸磷酸化，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為γ─谷氨酰基異羥肟酸，在酸性條件下與 Fe3+ 形成 Hydroxamate-Fe3+復(fù)合物 ，通過檢測(cè)該復(fù)合物在 535 nm 波長(zhǎng)處的 OD 值，進(jìn)而得出γ-GK 酶 活力大小。該酶催化的反應(yīng)方程式：ATP+L-glutamate=ADP+L-glutamate 5-phosphate。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 10mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.8mL 蒸餾水溶解備用。 試劑五 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 研缽、冰和蒸餾水。 四、γ-谷*酸激酶（γ-GK）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣本情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測(cè)，若渾濁則離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 可見分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 535nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑解凍至室溫。 ③ 在 EP 管中依次加入： 試劑（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 150 150 試劑一 150 120本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 150 150 試劑三 150 150 試劑四 30 混勻，37℃水浴 60min 試劑五 300 300 混勻，反應(yīng) 2min 后，8000rpm，4℃離心 10min，取全部上清 液于 1mL 玻璃比色皿中，535nm 處分別讀取吸光值 A，△A=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管（每個(gè)測(cè)定管須設(shè)一個(gè)對(duì)應(yīng)的對(duì)照管）。 【注】若ΔA 的值在零附近徘徊，則可加大樣本量 V1（如增至 200μL，則試劑一相應(yīng)減少）， 則改變后的加樣體積 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算 單位定義：每毫克組織蛋白在每小時(shí)內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 谷氨酰羥肟酯所需的酶量定義為 一個(gè)酶活力單位。 γ-GK 活性(nmol/h/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=240×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算 單位定義：每克組織在每小時(shí)內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 谷氨酰羥肟酯所需的酶量定義為一個(gè)酶 活力單位。 γ-GK 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=240×ΔA÷W 3、按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位定義：每 104個(gè)細(xì)胞在每小時(shí)內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 谷氨酰羥肟酯所需的酶量定義為一 個(gè)酶活單位（U）。 γ-GK 活性(nmoL/min /104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.48×△A 4、液體中酶活力計(jì)算: 單位定義：每毫升液體在每小時(shí)內(nèi)催化產(chǎn)生 1 nmol 谷氨酰羥肟酯所需的酶量定義為一 個(gè)酶活力單位。 γ-GK 活性(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=240×ΔA V---提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.15mL； V2---反應(yīng)體系總體積：9×10-4 L； d---光徑，1cm； T---反應(yīng)時(shí)間，60min=1h； W---樣本質(zhì)量，g； ε---摩爾消光系數(shù)，2.5×104 L/mol/cm； Cpr----樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。