γ-谷an酸激酶(γ-GK)試劑盒,微板法

γ-谷an酸激酶(γ-GK)試劑盒,微板法

γ-谷an酸激酶(γ-GK)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 γ-谷*酸激酶（γ-GK）酶活測定試劑盒說明書 （貨號：WS5011W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： γ-谷*酸激酶(γ-GK，EC 2.7.2.11)是脯*酸生物合成途徑中的關鍵酶之一。催化由谷*酸生成脯*酸途徑的步反應。 本試劑盒利用γ-GK 催化谷*酸磷酸化，進一步與轉化為γ─谷氨酰基異羥肟酸，在酸性條件下與 Fe3+形成 Hydroxamate-Fe3+復合物 ，通過檢測該復合物在 535 nm 波長處的 OD 值，進而得出γ-GK 酶活力大小。該酶催化的反應方程式：ATP+L-glutamate=ADP+L-glutamate 5-phosphate。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 6mL 蒸餾水溶解備用。 試劑三 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑五 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、γ-谷*酸激酶（γ-GK）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣本情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、 樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測，若渾濁則離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 540nm。 ② 所有試劑解凍至室溫。 ③ 在 EP 管中依次加入： 試劑（μL） 測定管 對照管 樣本 50 50 試劑一 50 40 試劑二 50 50本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 50 50 試劑四 10 混勻，37℃水浴 60min 試劑五 100 100 混勻，反應 2min 后，8000rpm，4℃離心 10min，取 200μL 上清液于 96 孔板中，535nm 處分別讀取吸光值 A，△A=A 測定管-A 對照管（每個測定管須設一個對應的對照管）。 【注】若ΔA 的值在零附近徘徊，則可加大樣本量 V1（如增至 80μL，則試劑一相應減少），則 改變后的加樣體積 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白在每小時內催化產生 1 nmol 谷氨酰羥肟酯所需的酶量定義為 一個酶活力單位。 γ-GK 活性(nmol/h/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=480×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織在每小時內催化產生 1 nmol 谷氨酰羥肟酯所需的酶量定義為一個酶 活力單位。 γ-GK 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=480×ΔA÷W 3、按細菌/細胞數量計算： 單位定義：每 104個細胞在每小時內催化產生 1 nmol 谷氨酰羥肟酯所需的酶量定義為一 個酶活單位（U）。 γ-GK 活性(nmoL/min /104 cell)= [ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.96×△A 4、液體中酶活力的計算： 單位定義：每毫升液體在每小時內催化產生 1 nmol 谷氨酰羥肟酯所需的酶量定義為一個 酶活力單位。 γ-GK 活性(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=480×ΔA V---提取液體積，1mL； V1---加入反應體系中樣本體積，0.05mL； V2---反應體系總體積：3×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； T---反應時間，60min=1h； W---樣本質量，g； ε---摩爾消光系數，2.5×104 L/mol/cm； Cpr----樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。