芳基酰胺酶活性測定試劑盒

芳基酰胺酶活性測定試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 芳基酰胺酶活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS3340F 分光法 48 樣） 一、產品簡介： 芳基酰胺酶(aryl-acylamidase) (EC 3. 5. 1.3)，廣泛存在于動物、植物、微生物中，可水 解帶有酰胺基團的化合物，是生物體內農藥及其他外源物質的重要水解酶之一。 本試劑盒采用芳基酰胺酶水解底物產生對硝基苯胺，在波長 405nm 處有吸收峰。 通過檢測生成的產物對硝基苯胺在 405nm 處的增長速率即可得出該酶活性大小。 二、。 測試盒組成和配制： 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL玻璃比色皿（光徑1cm）、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、 研缽、乙醇、冰和蒸餾水。 四、芳基酰胺酶活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取。 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 405nm，蒸餾水調零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 1mL 玻璃比色皿中依次加入： 【注】1. 加完試劑二即啟動反應，所以試劑二加完混勻后立即檢測，若 A2 值大于 1.5，可對樣本 進行稀釋，稀釋倍數需代入公式重新計算。 試劑名稱 規格 保存要求 備注 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 8mL×1 支 4℃保存 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若要重新做標曲則用到該試劑。 試劑名稱（μL） 測定管 試劑一 480 樣本 160 試劑二 160 混勻，立即于 405nm處讀取 A1值，37℃反應 30min 后讀取 A2 值。ΔA=A2-A1。本試劑盒僅供科研使用 2 2. 若ΔA小于0.005，可增大樣本量V1（如增至320μL，試劑一相應減少），則改變后的V1 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線：y = 0.0117x + 0.0041：x 為標準品(nmoL)，y 為ΔA。 2、按樣本鮮重計算： 酶活定義：在 37℃，每克組織每分鐘催化產生 1nmoL 標準品定義為一個酶活單位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0041)÷0.0117]÷(W×V1÷V)÷T =17.806×(ΔA-0.0041)÷W 3、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：在37℃，每毫克組織蛋白每分鐘催化產生1nmoL標準品定義為一個酶活單位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/mg prot)= [(ΔA-0.0041)÷0.0117]÷(V1×Cpr)÷T =17.806×(ΔA-0.0041)÷Cpr 4、按細胞數量計算： 酶活定義：在 37℃，每 104個細胞每分鐘催化產生 1nmoL 標準品定義為一個酶活單位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/104 cell)= [(ΔA-0.0041)÷0.0117]÷(500×V1÷V)÷T=0.0356×(ΔA-0.0041) 5、按照液體體積計算： 酶活定義：在 37℃，每毫升液體每分鐘催化產生 1nmoL 標準品定義為一個酶活單位（U）。 芳基酰胺酶(nmoL/min/mL)= [(ΔA-0.0041)÷0.0117]÷V1÷T=17.806×(ΔA-0.0041) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.16mL； T---反應時間，30min； W---樣本質量，g； 500---細胞數量； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（10μmol/mL）：臨用前甩幾下或離心，使粉體落入底部，加入 0.1mL 乙醇，渦旋震蕩溶解后再加入 0.9mL 的蒸餾水混勻，得到 10μmol/mL 備用。 2 用蒸餾水把母液稀釋成以下濃度：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根據實際來 調整濃度。 3 160μL 標準品+640μL 試劑一，混勻后于 405nm 處讀取 A 值，依據結果即可制作標 準曲線。