6-磷酸葡萄糖胺合成酶試劑盒

6-磷酸葡萄糖胺合成酶試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 6-磷酸葡萄糖胺合成酶試劑盒說明書 （貨號：WS8550F 分光法 24 樣） 一、產品簡介： 6-磷酸葡萄糖胺合成酶（GlmS，EC 2.6.1.16）又名 6-磷酸果糖谷*酰胺氨基轉移酶(GFAT)， 是氨基己糖合成代謝途徑中第一步反應的催化酶，也是限速酶，該代謝途徑的最終產物鳥苷氮乙酰葡萄糖胺是生命體糖蛋白的前體和一些真菌細胞壁主要成分幾丁質的合成單體。 6-磷酸葡萄糖胺合成酶（GlmS）催化谷氨*胺和 6-磷酸果糖合成 6-磷酸葡萄糖胺和谷* 酸，本試劑盒通過檢測生成谷*酸的速率進而計算得出該酶活性的大小。 反應方程：L-glutamine + D-fructose 6-phosphate = L-glutamate + D-glucosamine 6-phosphate。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.2mL 蒸餾水溶解備用 試劑二 液體 40mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 2.4mL 蒸餾水溶解備用 試劑四 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑五 粉體 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 2.2mL 蒸餾水溶解備用 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該標曲。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、 研缽、冰和蒸餾水。 四、6-磷酸葡萄糖胺合成酶活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免 實驗樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測；若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 450nm，蒸餾水調零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 240 240本試劑盒僅供科研使用 2 試劑一 30 試劑二 330 360 混勻，37℃反應 30min（準確時間），立即于 95℃沸水中水浴 3 分鐘后， 上下振動幾下混勻后，室溫 8000rpm 離心 10min，上清液待測。 ③ 顯色反應：在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 試劑二 300 300 試劑三 40 40 試劑四 20 20 上清液 400 400 試劑五 40 40 混勻，30℃反應 30min，全部液體轉移至 1mL 玻璃比色皿中，于 450nm 處讀取各管吸光值 A（若反應未終止即吸光值還在上升，須延長反 應 時間），△A=A 測定-A 對照（每個樣本需做一個自身對照）。 【注】若△A 差值在零附近徘徊，可在 37℃反應階段延長反應時間 T（如增至 1h），或加大加樣體積 V1（如增至 300μL，則試劑二相應減少），或增加樣本制備階段取樣質量 W（如增加到 0.2g）則 改變后的反應時間 T 或樣本體積 V1 或 W 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程為 y = 14.453x - 0.0005，x 為谷*酸摩爾濃度（μmol/mL），y 為△A。 2、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每小時生成 1 nmoL 的谷*酸定義為一個酶活力單位。 GlmS (nmoL/h/mg prot) =[(ΔA+0.0005)÷14.453]×V2×103÷(V1×Cpr) ÷T =346×(ΔA+0.0005)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每小時生成 1 nmol 的谷*酸定義為一個酶活力單位。 GlmS（nmoL/h/g 鮮重）=[(ΔA+0.0005)÷14.453]×V2×103÷(W×V1÷V) ÷T =346×(ΔA+0.0005)÷W 4、按細胞數量計算： 酶活定義：每 104個細胞每小時生成 1 nmol 的谷*酸 定義為一個酶活單位。 GlmS (nmoL/h/104 cell)=[(ΔA+0.0005)÷14.453]×V2×103÷(500×V1÷V)÷T=0.69×(△A+0.0018) 5、按照液體體積計算： 酶活定義：每毫升液體每小時生成 1 nmol 的谷*酸 定義為一個酶活單位。 GlmS (nmoL/h/mL)=[(ΔA+0.0005)÷14.453]×V2×103÷V1÷T=346×(ΔA+0.0005) V--提取液體積，1 mL； V1--加入樣本體積，0.24mL；本試劑盒僅供科研使用 3 V2--反應總體積，0.6mL； T--反應時間，30min=0.5h； W--樣本質量，g； Cpr--樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司 BCA 蛋白含量測定試劑盒； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（10μmol/mL）：標準品用 2mL 的蒸餾水溶解。（母液需在兩天內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個梯度標準品：0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1. μmol/mL。也可根據實際樣本來調整濃度。 3 依據顯色反應階段，測定管的加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。