半纖維素酶/木聚糖酶試劑盒

半纖維素酶/木聚糖酶試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 半纖維素酶/木聚糖酶測定試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS9070F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 半纖維素酶主要檢測木聚糖酶活力，可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總 稱，廣泛應(yīng)用于釀造和飼料工業(yè)中。 半纖維素酶在酸性下將木聚糖降解成還原性寡糖和單糖，進(jìn)一步與 3,5-二硝基水楊酸 發(fā)生顯色反應(yīng)，在 540nm 處有特征吸收峰，反應(yīng)液顏色深淺與酶解產(chǎn)生的還原糖量成 正比，通過測定反應(yīng)液在 540nm 吸光值增加速率，即可計(jì)算該酶活力大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 60mL 液體×1 瓶 4℃保存 試劑一 25mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部， 再加 12.5mL 試劑一溶解備用。 試劑三 21mL×1 瓶 -20℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器。 四、半纖維素酶活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織：稱取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷的 95%乙醇冰浴 勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經(jīng) 預(yù)冷的 80%乙醇混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。 再向沉淀中加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷提取液，渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測。 ② 細(xì)菌/培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì) 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間 隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：澄清液體直接檢測，若渾濁則 12000rpm，4℃，離心 15min，取上清待測。 2、上機(jī)檢測： 1 可見分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 540nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對(duì)照管 樣本 100 100 試劑一 100 100 試劑二 100 40℃孵育60min 試劑二 100 試劑三 200 200 混勻，沸水浴（95-100℃）5min，冷卻至室溫 蒸餾水 200 200本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，取出全部澄清液體至1mL玻璃比色皿（光徑1cm）中，于 540nm處讀取A，ΔA=A測定-A對(duì)照（每個(gè)測定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。 【注】1. 若 A 值大于 1.5，最后一步檢測時(shí)可進(jìn)行稀釋：如取 350μL 待檢液至比色皿中，再加 350μL 蒸餾水，相當(dāng)于稀釋倍數(shù) D 為 2，需帶入計(jì)算公式參與計(jì)算。 2. 若ΔA 小于 0.01，則可增加樣本加樣體積 V1（如增至 200μL，則試劑一減少為 0μL）， 則改變后的 V1 代入公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 1.4174x - 0.0429，x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量（μmol），y 是△A。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克蛋白每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生 1nmol 木糖所需酶量為一個(gè)酶活單位。 半纖維素酶活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0429)÷1.4174×103]÷(Cpr×V1÷V)÷T×D =117.6×(ΔA+0.0429)÷Cpr×D 3、按樣本重量計(jì)算： 酶活定義：每克樣本每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生 1nmol 木糖所需酶量為一個(gè)酶活單位。 半纖維素酶活力(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0429)÷1.4174×103] ÷(W×V1÷V)÷T×D =117.6×(ΔA+0.0429)÷W×D 4、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算： 酶活定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘分解木聚糖產(chǎn)生 1nmol 木糖所需酶量為一酶活單 位。 半纖維素酶活力(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0429)÷1.4174×103]÷(500×V1÷V)÷T×D =0.235×(ΔA+0.0429)÷W×D 5、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升液體樣本每分鐘分解木糖產(chǎn)生 1nmol 木糖所需酶量為一個(gè)酶活單位。 半纖維素酶活力(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0429)÷1.4174×103] ÷V1÷T×D =117.6×(ΔA+0.0429)×D V---提取液體積，1mL； V1---樣本體積，0.1mL； T---反應(yīng)時(shí)間，60min； W---樣本質(zhì)量，g； 木糖分子量---150.131； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（5mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4,0.6,0.8, 1. mg/mL。 3 100μL 標(biāo)準(zhǔn)品+100μL 試劑一+100μL 蒸餾水+200μL 試劑三，混勻，沸水浴（95-100℃） 5min，冷卻至室溫，再加 200μL 蒸餾水，混勻后取出全部液體至 1mL 玻璃比色皿（光 徑 1cm）中，于 540nm 處讀取吸光值 A。根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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